二神丸中药物炮制后增强“温肾暖脾·涩肠止泻”作用机理研究

【摘要】：饮片炮制、复方入药是中医临床用药的特色,近年关于中药炮制机理研究逐渐增多,但多以单味药为主,很少将其纳入复方中研究,导致中药炮制与中医临床用药相脱离,不能全面揭示中药炮制的实际意义。课题组前期在国家十一五支撑计划资助下,对二神丸中君药补骨脂盐炙后引药入肾,增强温肾暖脾止泻的功效做了一些研究。本课题在前期工作基础上,从复方的角度出发,研究药物炮制增效机理及科学内涵。目的本课题在国家自然科学基金面上项目“复方二神丸中药物炮制增效机理研究”(81274085)的支持下,对复方二神丸涩肠止泻的物质基础和作用机理进行研究。前期研究中,通过药效筛选出盐补骨脂和煨肉豆蔻组成的二神丸对急性腹泻或脾肾阳虚泄泻小鼠止泻效果最佳,且其止泻有效部位在石油醚部位。本文在前期基础上,建立符合脾肾阳虚泄泻证候的大鼠模型,并对二神丸止泻有效部位进行验证和评价,并基于中医辩证施治的治病原则,从“病因-脾肾阳虚”,“病症-泄泻”等体现中医辨证的“标”和“本”来研究补骨脂、肉豆蔻炮制品在复方二神丸中“温肾暖脾·涩肠止泻”的作用机理,为指导临床合理用药提供科学依据。方法采用炮制前后组方“药效一有效部位指纹图谱—有效成分体内代谢排泄过程—作用机理”对比研究模式,多角度、多层次地探讨补骨脂、肉豆蔻炮制在复方中增效的机理。1采用文献研究方法,整理古方二神丸的方源方义、主治脾肾阳虚所致五更泻的病因病机及脾肾阳虚泄泻动物模型的现代研究进展,为开展二神丸中药物炮制后增强“温肾暖脾·涩肠止泻”作用的机理研究提供理论依据。2在文献整理的基础上,采用病理病因相结合的造模方法,通过多项症候指标对模型进行评价,建立最符合中医证候的脾肾阳虚泄泻大鼠模型。3以脾肾阳虚泄泻(SKYD)模型大鼠为研究对象,运用髓染色法对主要脏器进行病理检测和分析,通过流式细胞术对模型大鼠给药前后的T细胞亚群(CD3/CD4/CD8)水平进行研究,‘探讨二神丸中药物炮制后增强“温肾暖脾”的作用；4运用ELISA(酶联免疫检测)法测定实验大鼠胃肠激素含量；运用16SrRNA实时荧光定量PCR检测实验大鼠肠道菌群的数量及种类,观察二神丸对实验大鼠肠道菌群的恢复情况；采用免疫组织化学技术(Immunohistochemistry,IHC)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质Western blot迹法等分别从组织水平、基因水平和蛋白水平研究二神丸对模型大鼠结肠AQP3表达的影响,探讨二神丸“涩肠止泻”作用机理。5通过生物机能实验系统,研究二神丸对家兔胃肠平滑肌收缩运动的影响,并观察其对4种不同作用机理的胃肠平滑肌兴奋剂(分别作用于M、H1、α及β2受体)的反馈作用,阐明二神丸抑制胃肠收缩的作用靶点。6采用中药复方药代动力学方法对复方在体内化学成分进行定性定量的分析,通过“血清指纹图谱研究→定位入血成分→入血成分药动学研究”路线对二神丸有效部位的入血成分及其在体内的经时过程进行研究；通过核磁共振检测分析二神丸有效部位给药后主要排泄产物的结构,阐明炮制对复方二神丸中药物成分的体内过程的影响。7采用体外实验方法,对二神丸有效部位的入血成分、排泄成分、相关文献报道的止泻活性成分等进行活性验证,阐明二神丸涩肠止泻的活性成分及其量效关系。结果1经“腺嘌呤十饮食失节(交替喂饲甘蓝和精炼猪脂)+劳倦过度(每日游泳至疲劳)+苦寒泻下(灌服番泻叶)”复合式造模方法处理的实验大鼠：尿D-木糖排泄率降低、NOS活性和cGMP含量增高,脾脏、肾脏脏器指数增大,且肾脏有明显的病理特征,符合脾肾阳虚泄泻的症候。2二神丸炮制品石油醚提取物能显著降低SKYD模型大鼠的腹泻指数和小肠推进率(P0.05),验证了复方二神丸“涩肠止泻”的物质基础为石油醚提取物。二神丸石油醚提取物对脾肾阳虚症所致肾脏肿大、肾脏严重病变(如肾小球毛细血管丛紧闭肾小管坏死、间质增生等)病理状态起到一定改善作用,并能显著增加其外周血CD3+, CD3+CD4+百分比含量,减低CD3+CD8+百分比含量(P0.05-0.01),且二神丸中药物炮制后作用增强。3二神丸石油醚提取物能显著降低SKYD模型大鼠血清胃动素、胃泌素含量,增加肠道中双歧杆菌和乳酸杆菌含量(P0.01),降低大肠杆菌和粪肠球菌含量(P0.01),提高SKYD模型大鼠结肠中AQP3的表达量,且炮制品二神丸组大鼠结肠AQP3的表达显著高于生品二神丸组(P0.05),且对正常家兔离体十二指肠和回肠的收缩运动有显著的抑制作用(P0.01-0.05),主要表现为使肠肌平均张力下降、振幅降低、频率减少,且二神丸中药物炮制后作用明显增强。而二神丸石油醚提取物对磷酸组胺(HIS)引起的肠肌兴奋有明显的拮抗作用。4二神丸石油醚提取物的主要入血成分是补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚,主要排泄成分是补骨脂酚,与生品二神丸相比,二神丸中药物炮制后可使补骨脂素、异补骨脂素在血中的最大达峰时间提前,最大血药浓度增高；补骨脂酚总排泄率显著降低(P0.01)。5主要入血成分补骨脂素、异补骨脂素及补骨脂酚对豚鼠回肠平滑肌的平均张力、振幅和频率与空白组相比无差异；文献报道肉豆蔻的止泻活性成分甲基丁香酚和甲基异丁香酚能显著降低豚鼠回肠的平均张力,减小振幅和频率(P0.01),两者对豚鼠回肠平滑肌运动频率的半数抑制浓度(IC50)分别为0.949μmol·L-1 和 3.380 μmol·L-1。结论盐炙补骨脂和麸煨肉豆蔻组方的二神丸,可显著改善脾肾阳虚泄泻模型大鼠的异常脏器指数,修复肾脏病理状态,并通过增高体内血清中CD3+, CD3+CD4+及降低CD3+CD8+百分比含量进而调节T淋巴细胞亚群水平的平衡,最终达到“温肾暖脾”作用；可显著调节脾肾阳虚泄泻模型大鼠的异常胃肠激素水平,并通过扶植肠道正常菌群生长和减低致病菌群来调整肠道菌群的失调,通过增加结肠AQP3的表达量来增强大鼠结肠对水的吸收,是通过抗H,受体兴奋来抑制胃肠平滑肌的收缩运动,最终达到“涩肠止泻”的作用。复方二神丸中,君药补骨脂主要以“补”为主,臣药肉豆蔻以“止泻”为主,两者可能共同参与调节肠道菌群的平衡。二神丸中药物炮制后增强“温肾暖脾·涩肠止泻”作用可能与减慢补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚在体内的消除和分布过程,延长其在体内滞留时间,并减低补骨脂酚的总排泄率,提高了生物利用度有关。

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