【专家解说】：反相高效液相色谱法测定人血浆中单硝酸异山梨酯的浓度 论文
单硝酸异山梨酯（isosorbide mononitrate，ISMN）为硝酸异山梨酯的主要活性代谢产物。可通过扩张外周血管，特别是增加静脉血容量，减少回心血量，降低心脏前后负荷，从而减少心肌耗氧量；同时还可以促进心肌血流重新分布，改善缺血区血流供应，单硝酸异山梨酯可能通过这两方面发挥抗心肌缺血作用。目前国内复方单硝酸异山梨酯缓释片上市不久，为考察其相对生物利用度及了解药代动力学参数，本文建立了测定血浆中单硝酸异山梨酯的反相高效液相色谱法。有关血中单硝酸异山梨酯的测定，文献报道有气相色谱-电子捕获法［1～3］，高效液相色谱法［4～6］，而反相高效液相色谱法报道少见。本研究建立简单、灵敏、准确的RP-HPLC法，可广泛用于复方单硝酸异山梨酯缓释制剂生物利用度和药代动力学的测定以及治疗药物监测。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Agilent-1100高效液相色谱分析仪，配备G1313A自动进样器和G1315BDAD检测器，Agilent色谱工作站。
1.2 色谱条件 色谱柱：预柱Ultrasphere C18柱（5 μm，4.6 mm×45 mm），分析柱Ultrasphere C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相：甲醇-正己烷-乙腈（90∶6∶4，pH=7.4），流速1.0 mL/min；检测波长220 nm，灵敏度为0.01 AUFS。
1.3 药品与试剂 单硝酸异山梨酯（河南天方药业有限公司）；卡马西平（中国药品生物制品检定所）。乙腈、正己烷为色谱纯，甲醇为分析纯。
1.4 标准溶液 准确称取单硝酸异山梨酯10.0 mg及卡马西平10.0 mg，分别置于2个50 ml容量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度即成单硝酸异山梨酯和内标卡马西平贮备液（200 mg/L），-20 ℃保存可稳定2个月，临用时将贮备液用重蒸水稀释至所需浓度，即得单硝酸异山梨酯系列工作液（8000，4000，2000，1000，500，250，125 μg/L）和内标稀释液（126 μg/L）。
2 方法与结果
2.1 标准曲线 取正常人空白血浆各0.5 ml共7份，分别加入单硝酸异山梨酯标准系列工作液100 μl，使各管血浆浓度分别为1600，800，400，200，100，50，25 μg/L，再分别加入内标稀释液100 μl，0.25 mol/L氢氧化钠溶液100 μl，混匀后用乙醚5.0 ml涡旋混合萃取3 min，离心（2500 r/min）10 min，小心将有机相4 ml移至另一尖底离心管内，置于40 ℃水浴中氮气吹干，残渣溶于100 μl流动相，取20 μl进样。由单硝酸异山梨酯与卡马西平的峰面积比（Y）对单硝酸异山梨酯浓度（X）作标准曲线，计算得回归方程为:Y=0.2297＋0.5586 X（r=0.999，n=7），表明在血药浓度25～1600 μg/L范围内有良好线性关系。
2.2 样品测定 取受试者血浆样品0.5 ml，加入重蒸水100 μl，按标准曲线制备项下操作，在标准曲线上求出各样品中单硝酸异山梨酯浓度。
2.3 保留时间及检测限 空白及样品血浆色谱图（见图1）中单硝酸异山梨酯及内标卡马西平的保留时间分别为6.8 min和8.4 min（分离度为2.0）。单硝酸异山梨酯的最低检出量为2 ng，最低检出浓度为10 μg/L（以信噪比≥3计）。
2.4 方法精密度 取含单硝酸异山梨酯高、中、低3种浓度的样品，于同日内连续测定5次，精密度分别为1.5%、2.06%、3.10%；4日内重复测定5次，精密度分别为3.61%、3.98%、4.27%。
2.5 方法回收率 取空白血浆3份，配成含单硝酸异山梨酯高、中、低3种浓度的样品，每个浓度样品分成5份按前述样品测定法测定，计算方法回收率分别为97.0%、98.1%、102.1%。
图1 色谱图 略
3 讨论
3.1 检测波长选择 单硝酸异山梨酯无明显紫外吸收峰，仅在近紫外区有吸收（见图2），为提高检测灵敏度，检测波长应越短越好，但由于流动相在近紫外区吸收明显增高，综合二者因素，本文采用220 nm测定既不使流动相本底吸收太高（本底吸收值0.50），又能达到测定血浆中单硝酸异山梨酯灵敏度要求。
图2 单硝酸异山梨酯紫外吸收曲线 略
3.2 萃取条件选择 按赵弈等报道［3］，在pH 7.0缓冲液存在下用乙酸乙酯提取，紫外检测杂质峰较多。本文用乙醚提取，回收率与乙酸乙酯相当，但杂质峰较少，且在碱性条件下提取比中性条件下杂质峰更少。
本文建立的测定血浆中单硝酸异山梨酯的反相高效液相色谱法具有操作简便、灵敏、准确等特点，能满足药代动力学和生物利用度研究的需要，已用于复方单硝酸异山梨酯缓释片的生物利用度和药代动力学的测定以及治疗药物监测（待发表），结果准确可靠，为单硝酸异山梨酯人血浆中浓度测定提供了一种新的选择。
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