1627年，荷兰人范·埃尔蒙做了盆栽柳树称重实验，得出植物的重量主要不是来自土壤而是来自水的推论。他没有认识到空气中的物质参与了有机物的形成。
1642年，比利时科学家海尔蒙特（Jan Baptist van Helmont）出于对亚里士多德观点的怀疑，做了类似范·埃尔蒙的实验：将一棵重2．5kg的柳树苗栽种到一个木桶里，木桶里盛有事先称过重量的土壤。以后，他每天只用纯净的雨水浇灌树苗。为防止灰尘落入，他还专门制作了桶盖。五年以后，柳树增重80多千克，而土壤却只减少了100g，海尔蒙特为此提出了建造植物体的原料是水分这一观点。但是当时他却没有考虑到空气的作用。
1771年，英国的普里斯特利（J.Priestley,1733-1804）发现植物可以恢复因蜡烛燃烧而变“坏”了的空气。他做了一个有名的实验，他把一支点燃的蜡烛和一只小白鼠分别放到密闭的玻璃罩里，蜡烛不久就熄灭了，小白鼠很快也死了。接着，他把一盆植物和一支点燃的蜡烛一同放到一个密闭的玻璃罩里，他发现植物能够长时间地活着，蜡烛也没有熄灭。他又把一盆植物和一只小白鼠一同放到一个密闭的玻璃罩里。他发现植物和小白鼠都能够正常地活着，于是，他得出了结论：植物能够更新由于蜡烛燃烧或动物呼吸而变得污浊了的空气。但他并没有发现光的重要性。
1779年，荷兰的英格豪斯(J.Ingen-housz）证明：植物体只有绿叶才可以更新空气，并且在阳光照射下才成功。
1785年，随着空气组成成分的发现，人们才明确绿叶在光下放出的气体是氧气，吸收的是二氧化碳。
1804年，法国的索叙尔通过定量研究进一步证实：二氧化碳和水是植物生长的原料。
1845年，德国科学家梅耶（R.Mayer） 根据能量转化与守恒定律明确指出，植物在进行光合作用时，把光能转换成化学能储存起来。
1864年，德国的萨克斯发现光合作用产生淀粉。他做了一个试验：把绿色植物叶片放在暗处几个小时，目的是让叶片中的营养物质消耗掉，然后把这个叶片一半曝光，一半遮光。过一段时间后，用碘蒸汽处理发现遮光的部分没有发生颜色的变化，曝光的那一半叶片则呈深蓝色。这一实验成功的证明绿色叶片在光和作用中产生淀粉。
1880年，美国的恩格尔曼发现叶绿体是进行光合作用的场所，氧是由叶绿体释放出来的。他把载有水绵（水绵是多细胞低等绿色植物，其细而长的带状叶绿体是螺旋盘绕在细胞内）和好氧细菌的临时装片放在没有空气的暗环境里，然后用极细光束照射水绵通过显微镜观察发现，好氧细菌向叶绿体被光照的部位集中：如果上述临时装片完全暴露在光下，好氧细菌则分布在叶绿体所有受光部位的周围。恩格尔曼的实验证明了氧气是从中叶绿体释放出来的；叶绿体是绿色植物进行光合作用的场所。
1897年，“光合作用”这个名称首次在教科书中出现。
1941年，美国科学家鲁宾（S.Ruben）和卡门(M.Kamen）采用同位素标记法研究了“光合作用中释放出的氧到底来自水，还是来自二氧化碳”这个问题，这一实验有力地证明光合作用释放的氧气来自水。
20世纪30年代初，荷兰生物学家范.尼尔发现了细菌光合作用。一些细菌在只有无机培养基（CO2、H2S、光）中也能生长，这个过程同绿色植物生长很相似。唯一不同之处在于不用水作氢的来源，而用H2S（硫化氢）作氢供体，并且不放氧气。这一重要发现由于当时光合作用研究最大权威瓦勃的怀疑而曾一度为人们所否认。直到40年代有人用实验证明细菌光合作用与植物光合作用是可以相互转换的。
20世纪40年代，美国科学家卡尔文（M.Calvin）用小球藻做实验：用14C标记的CO2（其中碳为14C）供小球藻（一种单细胞的绿藻）进行光合作用，然后追踪检测其放射性，最终探明了二氧化碳中的碳在光合作用中转化成有机物中碳的途径，这一途径被成为卡尔文循环。
21世纪初，合成生物学的兴起，人工设计与合成生物代谢反应链成为改造生物的转基因系统生物技术，2003年美国贝克利大学成立合成生物学系，开展光合作用的生物工程技术开发，同时美国私立文特尔研究所展开藻类合成生物学的生物能源技术开发，将使光合作用技术开发在太阳能产业领域带来一场变革。
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