藻胆蛋白清洁分离纯化技术研究

【摘要】：局部水体中藻类繁盛易引起水体富营养化,但藻类对水体生物自净系统的稳定性也发挥着重要的作用。我国藻类资源丰富,仅海水养殖面积就达到120.80千公顷,年产量2.57万吨,具有巨大的开发优势和潜力。然而目前藻类产品的开发深度很小,仅限于作为食品、工业原料直接进入市场,售价低廉。藻胆蛋白是蓝藻、红藻中一类水溶性荧光色素蛋白,可吸收太阳光谱中450~660 nm波段的可见光。由于其特有的生理活性和高效的荧光特性,可应用于食品、化妆品、医药保健和荧光标记等领域。然而藻胆蛋白的提取工艺复杂,成本高,得率低,因此市场价格昂贵,致使其在各领域的应用受到限制。本课题旨在研究一种经济、高效、快速、处理量大,且可低成本获得高纯度、高产量藻胆蛋白的清洁环保新工艺。并尝试用纯化的高纯度、高吸光性的藻胆蛋白作为环境功能材料敏化TiO2电极,产生色素增感效应。藻胆蛋白的纯度为其在特征吸收峰处的特征吸光值和总蛋白在280 nm处吸光值的比值。蛋白质的纯度是衡量提纯效果的重要指标。论文的主要研究内容和研究结果如下:依据等离子放电原理,建立多针-板电晕放电技术以用于藻体细胞的破碎。结果表明:输出电压8 kV,放电时间仅1 min即可有效破碎蓝藻干藻细胞,获得纯度为0.46的C-藻蓝蛋白(C-PC)细胞破碎液;输出电压8 kV,放电时间5min,即可有效破碎红藻鲜藻细胞,获得纯度为0.56的R-藻红蛋白(R-PE)细胞破碎液。与其他细胞破碎方法相比,多针-板电晕放电效果明显提高,且操作简单,处理量大,破碎时间短,成本低,效率高,环保无污染。研究不同吸附剂和絮凝剂对藻胆蛋白细胞破碎液的除杂效能,以提高藻胆蛋白的纯度。结果表明活性炭吸附去除杂蛋白的效果最好。在浓度为20 g/L、35g/L时,分别获得C-PC、R-PE最高纯度0.71、1.03,高于藻胆蛋白食品级标准0.7。吸附剂、絮凝剂的使用,虽然可以提高藻胆蛋白的纯度,但也会引起目的蛋白被吸附,使回收率降低。研究一步及多步硫酸铵盐析法,探索最佳盐析条件以获得高纯度的C-PC、R-PE。结果表明:C-PC三步盐析效果最好,纯度达到1.29,回收率达到71.77%。R-PE一步盐析效果最好,纯度达到1.13,回收率达到84.89%。获得CPC、R-PE纯度均高于食品级标准。通过对藻胆蛋白分子结构的分析,探讨成相机理,选择确立适合的聚合物和盐组成,构建最佳的双水相体系,用以从蓝藻与红藻中提取并纯化C-PC、RPE。结果表明:聚乙二醇(PEG)1000/磷酸钠、pH 5.85,TLL 28.50%,Vr 0.16双水相体系,提取C-PC效果最好。一次双水相萃取(ATPE)C-PC的纯度由0.46提高到1.33,回收率89.52%,分相时间10 min,体系含水量77.78%,3次ATPE获得最高纯化因子5.01。PEG1500/酒石酸钾钠、pH 8.06、TLL 22.30%、Vr0.12双水相体系提取R-PE效果最好,一次ATPE纯度由0.47提高到1.47,回收率为84.42%,分相时间12 min,体系含水量74.26%,2次ATPE获得最高纯化因子3.60。因此构建的双水相体系具有低溶剂、低成本、快速、清洁环保的特点。利用已建立的藻体破碎和双水相体系为核心,优化组合其它流程,确立最佳提取新工艺,从生长旺盛、分布广泛、年产量高的3种蓝藻、4种红藻中提取纯化C-PC和R-PE。分析藻胆蛋白提取对环境的影响。结果表明:螺旋藻(spirulina platensis)是提取C-PC的最好原料,最佳工艺提取C-PC纯度达到3.42,高于药品级,回收率89.17%;龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)是提取RPE的最好原料,最佳工艺提取的R-PE纯度达到3.07,高于药品级,回收率79.05%。坛紫菜(porphyra haitanensis)和条斑紫菜(porphyra yezoensis)提取R-PE纯度均高于2.0,回收率超过70%,因此也可以作为R-PE提取的优质原料。直接应用干藻粉提取C-PC、R-PE,也能达到很好的提取效果,而且比用鲜藻更安全、便利。整个提取工艺操作简单、成本低、时间短、清洁环保,产品高收益。应用获得的高纯度C-PC、R-PE敏化TiO2电极,使敏化电极在太阳光的可见光波段具有吸光特性。而且没有影响TiO2光电极对紫外光部分的吸收。施加一定偏置电压,R-PE敏化TiO2电极在可见光照射下可以产生光电流。但电极的光电转化率较低。天然捕光蛋白质作为染料敏化剂使染料敏化电池更为清洁环保。

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